生產菌株的選育與生物發酵消泡劑

發布時間：2012-11-6 10:44

肌苷的生產菌株多為枯草桿菌腺嘌呤缺陷型由于普遍存在著使IMP脫磷酸化的酶類，所以，比較容易得到積累肌苷和次黃嘌呤的突變株。又由于IMP對細胞膜滲透性很差，因此，肌苷生物發酵消泡劑的發酵比肌苷酸的生物發酵消泡劑發酵來得容易。有人曾研究枯草桿菌嘌呤核苷酸合成中，各種終產物對關鍵酶的反饋抑制效果，發現PRPP轉酰胺酶專一性地受AMP, ADP的完全抑制，但受IMP,GMP, XMP和ATP的抑制卻很弱，這是與產氣氣桿菌等的不同點。在GMP的生物合成中，IMP脫氫酶受GMP抑制最強；其次是ATP, XMP, GTP。IMP生物合成酶系和AMP生物合成酶系為腺嘌呤化合物所阻遏。由IMP合成AMP, GMP兩種核苷酸，傾向于優先合成GMP。根據這樣的代謝調節機制，使用芽孢桿菌屬的腺嘌呤缺陷型突變株進行肌苷生物發酵消泡劑的發酵時，必須在不明顯抑制菌體生長的范圍內，盡量降低培養基中腺嘌呤濃度（保持在不能引起反饋調節的濃度），從而有利于肌苷的積累。一步選育不受腺嘌呤系核苷酸代謝控制的突變株，也是增加肌苷積累的重要手段。這些突變株的獲得包括抗代謝類似物，如抗8-AG（8-氮鳥嘌呤），抗8-AX（8-氮雜黃嘌呤）等。值得注意的是：在誘導8-AGr或8-AXr突變株，選育肌苷高產菌株時，使用的出發菌株應該是喪失腺嘌呤脫氨酶的突變株。這是因為喪失dea，能提高出發菌株對8-AG或8-AX等類似物的敏感性，易于分離到有效的抗性突變株。假如有dea存在，腺嘌呤就會被脫氨化而轉變為次黃嘌呤，生成的次黃嘌呤能解除8-AX對菌體生長的抑制作用。另外肌苷分解活性低的菌株對積累肌苷有利。 5-IMP的生產菌株的研究主要分為兩種類型由以芽孢桿菌屬細菌誘變的肌苷生產菌為出發菌株，進一步誘變，選育遺傳性地喪失了生物發酵消泡劑及降解核苷酸酶活性的突變株，育成IMP生產菌；將產量較低的IMP生產菌用遺傳的方法或通過對其培養條件的研究，加以改良，提高IMP的積累。選育第一類的生產菌時，必須先了解分解IMP成肌苷的酶，這些酶有5'-核苷酸酶、酸性磷酸酯酶及堿性磷酸酯酶等。使用的菌株究竟是含有哪種酶？此酶分布在細胞內的位置，然后誘變得到降低酶活的突變株。屬于第二類的微生物有短桿菌屬、棒桿菌屬及鏈霉菌屬等，它們與芽孢桿菌不同，其生物發酵消泡劑與降解核苷酸的酶活性本來很弱，這些菌株的腺嘌呤缺陷型能積累肌苷酸、次黃嘌呤，而不積累肌苷。以產氨短桿菌為例，對5ˊ-IMP的生物合成來說，關鍵酶PRPP轉酰胺酶受ATP,ADP,AMP及GMP的反饋抑制（抑制度為70%-100%）。被腺嘌呤阻遏，GMP和AMP是一種協同反饋抑制，當出現腺嘌呤或AMP缺陷型突變株時（喪失SAMP合成酶），在腺嘌呤亞適量下，該酶抑制即被解除。而IMP-XMP的IMP脫氫酶受鳥嘌呤的阻遏和GMP的抑制，因而積累IMP。同理，當出現鳥嘌呤或GMP缺陷突變株時亦能積累IMP。如在具有喪失SAMP合成酶遺傳標記的基礎上，能再設法增加喪失IMP脫氫酶的標記，即成為腺嘌呤和黃嘌呤缺陷型，IMP產量顯著提高。腺苷和5ˊ-腺苷酸的生產菌株選育曾報道有這樣兩種異亮氨酸缺陷型菌株，培養基中異亮氨酸添加濃度控制在0.2-0.3mg／ml為宜，關于異亮氨酸缺陷與腺苷積累的關系，目前尚未搞清；②黃嘌呤和鳥嘌呤雙重缺陷型菌株。 5ˊ鳥嘌呤的制造方法 ①利用微生物友酵法生產5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷酸，然后化學法制成GMP；②生物發酵消泡劑的發酵生產鳥苷，然后以酶法或化學法進行磷酸化得到GMP；③利用XMP或黃苷生產菌與能將XMP或黃苷轉化為GMP的菌株混合培養生產GMP；④直接生物發酵消泡劑的發酵法生產GMP。目前①和②用于工業生產。直接生物發酵消泡劑的發酵生產GMP，必須具備如下條件：①應當解除GMP生物合成的調節機制，首先要設法解除GMP對IMP脫氫酶的終產物抑制作用；②由于GMP與IMP一樣難于透過細胞膜，所以在解除反饋抑制前提下，還應設法改善細胞膜滲透性；③不分解生成的GMP。本文參考《發酵微生物學》一書。

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